广州伟伯科技有限公司
您的位置:首页 > 新闻中心 > MTT溶液的配置与实验注意事项
新闻中心
MTT溶液的配置与实验注意事项
2016.12.06   点击16319次

    一、MTT简介
    MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。其CAS编码298-93-1。

    MTT是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。

    二、MTT能做什么

    简单地说:是一种检测细胞存活和生长的方法。

    MTT主要有两个用途:

    1、药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;

    2、细胞增殖及细胞活性测定。

    三、MTT溶液的配制

    通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS(磷酸缓冲液)或生理盐水做溶剂。

    1、对于100mg这样的小包装,厂家都是将MTT放入小管中的,建议不要再用天平称量分装,而应该一次性将其全配制成溶液,如100mg用20m1PBS来溶解。具体做法:预先在5 0ml离心管(没有的话,可用培养瓶替代)加入20m1 PBS,从中先吸取500-1000u1 PBS装入含MTT的小管中,吹打若十次后将其移入50ml离心管,然后再混匀。可以重复几次,以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后,用0.22 um滤膜过滤以除去溶液里的细菌,分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10u1计算,一般每96孔板约击1m1,所以分装时可考虑每管分装1 ml。

    2、对于大包装,可按上述方法称取一部分溶解,也有人将粉剂分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加。

    3、配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60度水浴助溶。PBS配方:NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,调PH 7.4,定容至1L。

    注意事项:

    (1) 在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。

    (2) 配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感。

    (3) MTT一般最好现用现配,过滤后4度避光保存两周内有效,或配制成Smg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

    (4) MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套。

    四、MTT步骤:

    1、接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.

    2、培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

    3、呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

    4、比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

    五、MTT注意事项:

    1、选择适当得细胞接种浓度。

    2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

    3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

    4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。

    IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

    举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入 计算公式:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中:Xm:lg 最大剂量;I:lg(最大剂量/相临剂量);P:阳性反应率之和;Pm:最大阳性反应率;Pn:最小阳性反应率;抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值。公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 。

    Pm=0.95;Pn=0.06;P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1;Xm=lg0.1=-1;lgI=lg0.1/0.01=1;lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025;IC50=0.00025

    例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ,加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。

    一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150μl DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。

    一般要低于IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多。一般用1/2-1/3的IC50,作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10%(Annexin V),细胞周期的亚G0峰比较明显。

MTT(噻唑蓝)订购链接:

 产品编号 CAS编号 产品名称 产品规格
 3009495 298-93-1 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑 >98.0%(T)
 3060737 298-93-1 噻唑蓝溴化四唑 98%
 3251631 298-93-1 噻唑蓝 98%
 3251633 298-93-1 噻唑蓝 VetecTM reagent grade, 98%
 3447569 298-93-1 噻唑蓝 BR, 98.0%
广州伟伯科技有限公司 版权所有 CopyRight ©2006-2022, All Rights Reserved
工信部备案号:粤ICP备08114744号   Page Run Time: 0.0023